2008年11月2日星期日
Deskography：收集展示办公桌面照片
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于 08-10-30 通过 麦田蚂蚁 作者：noknowon
而今天介绍的Deskography 则允许用户上传展示自己办公的桌面照片。:》几乎所有桌面照片的主角都是电脑。看看大家的办公桌面都是怎样的吧，也许会发现不少好东西。
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于 08-11-1 通过 麦田蚂蚁 作者：noknowon
除了Google翻译，现在你还可以选择免费的网站翻译按钮 ConveyThis。ConveyThis包括Google翻译、BabelFish、Live Translator、SDL等主要在线翻译服务，可以将网页内容翻译为29种语言，还可以记录访问统计数据，从而可以看出那种语言翻译使用最频繁，哪个页面被翻译最多次数等等。
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2008年10月19日星期日
病毒的化学和结构研究阶段
病毒的化学和结构研究阶段 1935年，美国生化学家斯坦利（Stanley）发现烟草花叶病毒的侵染性能被胃蛋白酶破坏，在这一现象的启示下，他几乎磨了上吨重的感染花叶病的烟叶，企图用提酶的方法把病毒提纯出来。他得到了一小匙在显微镜下看来是针状结晶的东西，把结晶物放在少量水中，水就出现乳光了，用手指沾一点这溶液，在健康烟叶上磨擦几下，一星期以后这棵烟草也得了同样类型的花叶病。可见提纯的东西的确是有侵染性的烟草花叶病毒。今天在美国加州大学的原来斯坦利实验室里，仍然保留着一个标注着“Tob. Mos.”字样的瓶子，其中就盛着当年第一次提纯的烟草花叶病毒（简称TMV）。 根据各种试验结果，证明这种结晶物质是蛋白质，初步的渗透压和扩散测定表明，这种蛋白质的分子量高达几百万。其结晶制品的侵染性依赖于蛋白质的完整性，侵染性被认为是病毒蛋白质的一种性质。Stanley 的研究论文1953年发表在Science杂志上，他在论文中写道：“烟草花叶病毒是一种具有自我催化能力的蛋白质，它的增殖需要活体细胞的存在”。在获得TMV结晶之后的将近20年时间里，许多其他病毒也相继被结晶出来，1955年，Scaffer和Schwerdt成功地结晶了脊髓灰质炎病毒，它是第一个被结晶出来的动物病毒。然而，Stanley在他的结晶工作中，并未注意到病毒的含磷组分，1936年Bawden和Pirie等在纯化的TMV中发现了含磷和糖类的组分，它们以核糖核酸的形式存在， 通过热变化， 这种核酸可以从病毒粒子中释放出来，这一发现也被Stanley不久证实，Stanley及其同事证实几种不同植物病毒的核酸也能从核蛋白的形式中被分离出来。 TMV的结晶及其化学本质的发现是对医学和生物科学的巨大贡献，它不仅引导人们从分子水平去认识生命的本质，而且为分子病毒学和分子生物学的诞生奠定了基础。鉴于Stanley在TMV研究中的突出贡献，1946年他被授予诺贝尔奖，这是病毒学领域第一个获此殊荣的科学家。 最初从电子显微镜照片上看到的病毒是一些几乎类似的微粒，1939年，G.A.Kansche在电镜下直接观察到了TMV，指出TMV是一种直径为1.5nm，长为300nm的长杆状的颗粒，而番茄黄化花叶病毒（Tomato yellow mosaic virus, TYMV）颗粒为球形，直径为25nm。 早期电镜学家获得的最令人振奋的发现之一是细菌病毒----噬菌体，d′Herelle的噬菌体最初的电镜照片曾引起很大的轰动。噬菌体虽然非常微小，仅为10nm，但它们具有高度整齐而复杂的结构，它们有圆的头和起初被认为是尾巴的附属物，像个小蝌蚪。在争论多年以后，确定了噬菌体的附属物没有运动的功能，但它对噬菌体吸附于细胞表面和注射传染性核酸进入到细胞中却起了重要的作用。 病毒学研究的化学时期，还有一些比较重要的进展，1934年M.Schlesinger获得了纯化的噬菌体，1938年W.J.Elford测定了各种病毒颗粒大小等。但总的说来，这一阶段，病毒学工作者主要采用敏感动物（如小白鼠）或动物胚胎（如鸡胚）来研究病毒，分离鉴定了近百种病毒。同时在机体水平上研究了病毒的繁殖、发病机理和免疫反应等。只是微生物学的一个分支。同时，对病毒化学本质的了解也较为肤浅，对病毒的概念 这一时期，病毒学虽有很大的进展，但尚未形成独立学科，它还尚有很大争论，众说纷纭。
病毒的本质病毒是以基因分类的，有DNA和RNA两类，RNA病毒只在细胞质内活动，进不去细胞核，因为物不同类，所以不能相聚，DNA病毒则可以进入核内，因为细胞核内的遗传基因也是DNA，物以类聚，不但可聚，病毒的基因，还可以整合到细胞的DNA上，当掺入后，人体细胞与病毒形成了共同的编码组合，这种组合人类是很吃亏的，因为很不平等，病毒插入的基因片断是指挥系统，控制系统，它只提供一个模具，医学称模板，然后指令人体细胞为它干活，利用细胞原料，为它生产复制病毒产品，而且它从不可怜你，象地主老财，不管你有多辛苦，累死不管，活活将人折磨死，就象旧社会，目前人类还很难抵抗它。
病毒的合成复制大多需要一些活性酶，有些酶是病毒自带的，而有一些是人体细胞内现成的，研究抗病毒的人们，目前是把精力全都用在了这些酶上，酶是蛋白物质，所以现在的所有抗病毒产品全是抗酶和蛋白抑制剂，它们的抑制力，抵抗力，只能起到让病毒放慢制造的脚步，并不能根本杀死病毒，如果是自限性病毒，也还有效，如果是非自限性病毒，则极易死灰复燃。前功尽弃。这就是目前西医的水平。需要知道的是，各种病毒生命力并非极强，多数病毒，都能被日光，干燥，含氯制剂杀灭，但却不能在人体内应用，西医为什么不研究一下呢？中医能否得到一些提示呢？这是本文的主体思想。 了解病毒，就要了解基因，因为病毒就是一包基因，有点酶点缀，包上皮就是病毒，由于中医一般不学这些，所以我要尽量说清楚。基因是由碱基构成，碱基就是碱的基础成分，它有两种，嘌呤碱和嘧啶碱，在沉淀系数中，有质量轻重和飘浮沉淀不同，质轻飘浮的称嘌呤，质重沉淀的称嘧啶，嘌呤和嘧啶又各有两种，有腺嘌呤和鸟嘌呤，有胸腺嘧啶和胞嘧啶，四种物质，取三种为一组，叫基因组，三种的组合顺序有要求，叫编码组合，将每组相互连接，就形成了基因序列或基因连，再复杂一点，就是加上一点糖，一点氨基酸，一点氧，糖与平时吃的糖不太一样，吃的糖是六分子糖，简称六糖，核内的糖是五糖，甲乙丙丁戊，五号糖又称戊糖，是核内的专用糖，也叫核糖，糖的甜度为甘，也叫核苷，加上氨基酸，就叫核苷酸，或叫核酸。有氧无氧，是决定它是否能够进入细胞核的标志，核内是无氧的，叫脱氧核糖核酸，简写是DNA，细胞质内是有氧的，代号是RMA，病毒就是这样分类的。病毒的进化 人类拥有的病毒记录，或者病毒症状的记录，仅能追述到有记载的几千年前。而病毒的比较学研究，最多也只有80来年的历史。通过研究现存的病毒，人们希望能够了解病毒的起源和进化历程，预示病毒特别是人类病原病毒未来的变异和进化的方向，也即需要了解随着环境因素的变化，病毒将怎样变异? 变异的速度如何? 什么是变异的选择压力等? 从而能够有效地控制和避免人类及动物病毒的爆发。 要讨论病毒起源的学说，必须首先定义什么是病毒的起源以及如何判断这个起源的发生。这里我们将病毒或其遗传物质从它的前身大分子中独立出来进行自主复制和进化的时候，定义为病毒的起源。当病毒获得了决定自身繁殖和命运的遗传信息量时，它就获得了新的分类地位成为独立的遗传元件。 病毒的起源有三类学说： 1）退化性起源学说。退化性起源学说认为病毒是细胞内寄生物的退化形式。这种细胞内寄生的产生原因可能是由于微生物对某种不能穿过细胞膜的代谢发生了严重依赖。在细胞内，这类寄生物可以在不影响其生存的情况下逐渐丢失部分生物学功能。它们所必需保留的功能是具有可进行自主复制的DNA复制原点（顺式元件）、可以对复制进行调控的反式调控蛋白，以及能与宿主生物合成及复制系统相互作用的顺式和反式功能。最终的选择结构，就可产生一种专性细胞内寄生的DNA分子或质粒。 退化性起源学说可以把病毒的起源解释为两个阶段：首先，寄生物在细胞内产生独立复制的DNA质粒，然后，编码寄生物亚细胞结构单位的基因发生突变，形成病毒的衣壳蛋白。随着进化的发生，新获得的可在细胞间转移的特性被进一步选择下来。 2）病毒起源于宿主细胞中的RNA和（或）DNA成分的学说。这种学说认为，病毒是正常的细胞组分在进化过程中获得了自主复制的能力独立进化而来的。该学说能解释所有病毒的起源：DNA病毒起源于质粒或转移因子；反转录病毒起源于反转座子；RNA病毒起源于自主复制的mRNA。 3）病毒起源于具有自主复制功能的原始大分子的学说，即病毒起源于自主复制的RNA分子。核糖核酸多聚体具有自主复制的信息和能力。由于发现RNA分子具有催化化学反应的能力使得RNA为生命和病毒的起源的学说变得更具有吸引力。小而简单的RNA分子具有至少下列三种化学功能：1）核糖核酸酶的活性；2）能自我拼接去掉内部的核酸序列（核酸）；3）有实验表明，以RNA作引物可以合成依赖于模板的多聚胞嘧啶核酸。也就是说，RNA分子可以进行复制和进化相关的三个基本反应。 这些观察都有利于RNA是现今生物的进化起源的学说。首先是RNA的形成和复制，然后演变出RNA-蛋白介导的一系列反应，第三步产生了DNA。DNA由于比RNA稳定而最终成为遗传信息。RNA的反应性有利于它作为催化物而不利于它成为遗传物质。有些分子被包装在细胞和组织中，形成宿主细胞，另一些分子则自我复制或寄生在宿主细胞中，进化成为病毒。这一理论认为病毒与宿主是共进化的。现今的类病毒和卫星RNA，仍保留有部分的RNA催化性能，因而被一些学者认为是生命形式出现以前的RNA世界的化石。 研究病毒的进化有多种方法，可以通过序列同源性、基因组排列顺序、基因组的基因组成等方面构建病毒的进化树。单基因的进化树并不一定代表病毒的进化树，多个基因串联所获得的进化树比单基因的进化树具有更好的稳定性。基因组的排列顺序与单基因的进化分析从两个不同的侧面反映了病毒的进化。研究基因组成的演化对揭示基因的起源及病毒与宿主之间的关系具有重要意义。 DNA病毒和RNA病毒的进化。突变和重组都是DNA病毒进化的决定因素。DNA病毒容易在宿主体内形成持续性或慢性感染，它们可以在宿主体内存在多年而后爆发，其间可能几乎不发生变异，因此，这类病毒的变异速率可能表现得比裂解型病毒慢一些。一般来讲，DNA病毒不会像RNA病毒那样引起人类世界范围的流行性疾病。 RNA病毒引起的疾病流行和变异成为研究RNA病毒进化，特别是进化时间的良好素材。
病毒的本质病毒是以基因分类的，有DNA和RNA两类，RNA病毒只在细胞质内活动，进不去细胞核，因为物不同类，所以不能相聚，DNA病毒则可以进入核内，因为细胞核内的遗传基因也是DNA，物以类聚，不但可聚，病毒的基因，还可以整合到细胞的DNA上，当掺入后，人体细胞与病毒形成了共同的编码组合，这种组合人类是很吃亏的，因为很不平等，病毒插入的基因片断是指挥系统，控制系统，它只提供一个模具，医学称模板，然后指令人体细胞为它干活，利用细胞原料，为它生产复制病毒产品，而且它从不可怜你，象地主老财，不管你有多辛苦，累死不管，活活将人折磨死，就象旧社会，目前人类还很难抵抗它。
病毒的合成复制大多需要一些活性酶，有些酶是病毒自带的，而有一些是人体细胞内现成的，研究抗病毒的人们，目前是把精力全都用在了这些酶上，酶是蛋白物质，所以现在的所有抗病毒产品全是抗酶和蛋白抑制剂，它们的抑制力，抵抗力，只能起到让病毒放慢制造的脚步，并不能根本杀死病毒，如果是自限性病毒，也还有效，如果是非自限性病毒，则极易死灰复燃。前功尽弃。这就是目前西医的水平。需要知道的是，各种病毒生命力并非极强，多数病毒，都能被日光，干燥，含氯制剂杀灭，但却不能在人体内应用，西医为什么不研究一下呢？中医能否得到一些提示呢？这是本文的主体思想。 了解病毒，就要了解基因，因为病毒就是一包基因，有点酶点缀，包上皮就是病毒，由于中医一般不学这些，所以我要尽量说清楚。基因是由碱基构成，碱基就是碱的基础成分，它有两种，嘌呤碱和嘧啶碱，在沉淀系数中，有质量轻重和飘浮沉淀不同，质轻飘浮的称嘌呤，质重沉淀的称嘧啶，嘌呤和嘧啶又各有两种，有腺嘌呤和鸟嘌呤，有胸腺嘧啶和胞嘧啶，四种物质，取三种为一组，叫基因组，三种的组合顺序有要求，叫编码组合，将每组相互连接，就形成了基因序列或基因连，再复杂一点，就是加上一点糖，一点氨基酸，一点氧，糖与平时吃的糖不太一样，吃的糖是六分子糖，简称六糖，核内的糖是五糖，甲乙丙丁戊，五号糖又称戊糖，是核内的专用糖，也叫核糖，糖的甜度为甘，也叫核苷，加上氨基酸，就叫核苷酸，或叫核酸。有氧无氧，是决定它是否能够进入细胞核的标志，核内是无氧的，叫脱氧核糖核酸，简写是DNA，细胞质内是有氧的，代号是RMA，病毒就是这样分类的。病毒的进化 人类拥有的病毒记录，或者病毒症状的记录，仅能追述到有记载的几千年前。而病毒的比较学研究，最多也只有80来年的历史。通过研究现存的病毒，人们希望能够了解病毒的起源和进化历程，预示病毒特别是人类病原病毒未来的变异和进化的方向，也即需要了解随着环境因素的变化，病毒将怎样变异? 变异的速度如何? 什么是变异的选择压力等? 从而能够有效地控制和避免人类及动物病毒的爆发。 要讨论病毒起源的学说，必须首先定义什么是病毒的起源以及如何判断这个起源的发生。这里我们将病毒或其遗传物质从它的前身大分子中独立出来进行自主复制和进化的时候，定义为病毒的起源。当病毒获得了决定自身繁殖和命运的遗传信息量时，它就获得了新的分类地位成为独立的遗传元件。 病毒的起源有三类学说： 1）退化性起源学说。退化性起源学说认为病毒是细胞内寄生物的退化形式。这种细胞内寄生的产生原因可能是由于微生物对某种不能穿过细胞膜的代谢发生了严重依赖。在细胞内，这类寄生物可以在不影响其生存的情况下逐渐丢失部分生物学功能。它们所必需保留的功能是具有可进行自主复制的DNA复制原点（顺式元件）、可以对复制进行调控的反式调控蛋白，以及能与宿主生物合成及复制系统相互作用的顺式和反式功能。最终的选择结构，就可产生一种专性细胞内寄生的DNA分子或质粒。 退化性起源学说可以把病毒的起源解释为两个阶段：首先，寄生物在细胞内产生独立复制的DNA质粒，然后，编码寄生物亚细胞结构单位的基因发生突变，形成病毒的衣壳蛋白。随着进化的发生，新获得的可在细胞间转移的特性被进一步选择下来。 2）病毒起源于宿主细胞中的RNA和（或）DNA成分的学说。这种学说认为，病毒是正常的细胞组分在进化过程中获得了自主复制的能力独立进化而来的。该学说能解释所有病毒的起源：DNA病毒起源于质粒或转移因子；反转录病毒起源于反转座子；RNA病毒起源于自主复制的mRNA。 3）病毒起源于具有自主复制功能的原始大分子的学说，即病毒起源于自主复制的RNA分子。核糖核酸多聚体具有自主复制的信息和能力。由于发现RNA分子具有催化化学反应的能力使得RNA为生命和病毒的起源的学说变得更具有吸引力。小而简单的RNA分子具有至少下列三种化学功能：1）核糖核酸酶的活性；2）能自我拼接去掉内部的核酸序列（核酸）；3）有实验表明，以RNA作引物可以合成依赖于模板的多聚胞嘧啶核酸。也就是说，RNA分子可以进行复制和进化相关的三个基本反应。 这些观察都有利于RNA是现今生物的进化起源的学说。首先是RNA的形成和复制，然后演变出RNA-蛋白介导的一系列反应，第三步产生了DNA。DNA由于比RNA稳定而最终成为遗传信息。RNA的反应性有利于它作为催化物而不利于它成为遗传物质。有些分子被包装在细胞和组织中，形成宿主细胞，另一些分子则自我复制或寄生在宿主细胞中，进化成为病毒。这一理论认为病毒与宿主是共进化的。现今的类病毒和卫星RNA，仍保留有部分的RNA催化性能，因而被一些学者认为是生命形式出现以前的RNA世界的化石。 研究病毒的进化有多种方法，可以通过序列同源性、基因组排列顺序、基因组的基因组成等方面构建病毒的进化树。单基因的进化树并不一定代表病毒的进化树，多个基因串联所获得的进化树比单基因的进化树具有更好的稳定性。基因组的排列顺序与单基因的进化分析从两个不同的侧面反映了病毒的进化。研究基因组成的演化对揭示基因的起源及病毒与宿主之间的关系具有重要意义。 DNA病毒和RNA病毒的进化。突变和重组都是DNA病毒进化的决定因素。DNA病毒容易在宿主体内形成持续性或慢性感染，它们可以在宿主体内存在多年而后爆发，其间可能几乎不发生变异，因此，这类病毒的变异速率可能表现得比裂解型病毒慢一些。一般来讲，DNA病毒不会像RNA病毒那样引起人类世界范围的流行性疾病。 RNA病毒引起的疾病流行和变异成为研究RNA病毒进化，特别是进化时间的良好素材。
2008年9月25日星期四
TaKaRa RNAiso Reagent(Total RNA提取试剂)
本制品是一种快速方便的总RNA提取试剂，可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取总RNA。样品在RNAiso Reagent中能够充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层（下层)，RNA分布在上清层中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到总RNA。
RNAiso Reagent具有很强的广谱性，可以适用于各种样品的总RNA提取，提取过程方便快速，整个操作在一小时内便可以完成。经本制品提取的总RNA纯度高，基本不含蛋白质及基因组DNA，提取的RNA可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。
【试剂盒之外所需准备试剂】
氯仿、异丙醇、7 5 % 乙醇（ D E P C 处理水配制) 、RNase-free水（制备方法：使用RNase-free的玻璃瓶，向超纯水中加入DEPC至终浓度0.01%（v/v)，过夜搅拌后，高温高压灭菌。）
保存和运输
1. RNAiso Reagent在室温下可以保存12个月，为保证试剂质量，建议于2-8℃下避光保存。
2. 可以在常温下运输。
RNA提取实验前的准备
RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。
【使用器具】
尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。
1. 用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。
2. 然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。
【试剂配制】
用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60分钟)或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装(也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器)，使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。
实验操作
1. RNAiso Reagent的使用量情况如下。
2. 实验样品的研磨和匀浆。A. 贴壁培养细胞①倒出培养液，用1×PBS清洗一次。
②每10 cm2生长的培养细胞中加入2 ml的RNAiso
Reagent，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于
细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞
使其脱落(对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞)。
③将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
④室温静置5分钟。
B. 悬浮培养细胞
①将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000 g 4℃离心2分钟，弃上清。
②向每5×106个细胞中加入l ml的RNAiso Reagent。
C. 动物组织、植物材料样品
①将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量)。
②对于普通的RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的RNAiso Reagent，将研磨成粉末状的样品完全覆盖， 然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。对于特殊样品，如肝、脾、骨及软骨等，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的RNAiso Reagent的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。
③将匀浆液转移至离心管中，室温静置5分钟。
④ 12,000 g 4℃离心5分钟。
⑤小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀)。
③用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
④室温静置5分钟。
3. 总RNA的提取。
①向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Reagent的1/5体积量)，盖紧离心管盖，用力震荡(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待充分乳化溶液呈乳白状（无分相现象)后，再室温静置5分钟。
② 12,000 g 4℃离心15分钟。
③从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层,即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层)。
④向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟。
⑤ 12,000 g 4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。
4.RNA沉淀的清洗。
小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇l ml(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)。
5. RNA的溶解。
室温干燥沉淀2～5分钟（不可以离心或加热干燥，否则R N A 将会很难溶解， 有关R N A 溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明)，加入适量的RNasefree水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。
RNA提取操作流程简图
FAQs
[Q1] 一般情况下每毫克的组织或1×106个细胞中所能提取的RNA量如下表：
[Q2] 有关RNA的吸光度说明如下：
260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD260/OD280（R）体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8～2.0之间，当R<1.8时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R>2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用TEBuffer。
[Q3] 如何计算RNA的浓度？
RNA浓度=(OD260-OD320)×稀释倍数×0.04 μg/μl。
[Q4] 提取的RNA中含有多糖怎么办？
大多数的植物及动物肌肉组织中都含有大量多糖，其理化学性质与RNA十分接近，因此很难将其从RNA中除去，使用此类组织材料提取RNA时，建议增加RNAiso Reagent的使用量。
[Q5] RNA提取量较低怎么办？
①向组织材料中加入RNAiso Reagent后，请充分研磨匀浆使其充分裂解。
②相分离后请尽量完全回收上清液。
[Q6] 提取的RNA不溶怎么办？
① 75%乙醇清洗沉淀后不要干燥时间过长或加热干燥。
②可以于60℃加热5分钟后再于冰上溶解数小时。
③ RNA沉淀中含有不溶的蛋白质混合物时，应注意在相分离后吸取上清液时，不要让枪头接触蛋白层。
④溶解液更换为0.5%的SDS溶液（DEPC处理水配制)。
[Q7] OD260/OD280值<1.65，为什么？
① RNA应使用TE Buffer稀释后再进行吸光度值的测定，低离子强度或低pH值会使OD280值升高。
②样品裂解时加入的RNAiso Reagent量偏少，造成蛋白变性不充分，可以再次对RNA溶液进行苯酚/氯仿抽提，以除去蛋白。
③含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足5分钟。
③提取的组织材料中含有大量的RNA分解酶，而RNAiso Reagent的添加量不够。
④相分离后，吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染。
⑤ RNA未充分溶解。
[Q8] 提取的RNA降解，为什么？
①使用的组织材料不够新鲜。提取RNA的组织材料应采用新鲜的组织材料，或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存。
②提取RNA时使用的试剂及器材中混有RNA分解酶。
[Q9] 提取的RNA中含有DNA污染，为什么？
①裂解组织或细胞使用的RNAiso Reagent量偏少。
②使用的组织材料中含有大量的有机溶剂（如：乙醇、异丙醇等)、高浓度的Buffer、碱性溶剂等。
③如果提取的RNA中含有DNA时，可以使用DNase I
(RNase Free；TaKaRa Code：D2215）进行DNA消化。
■参考文献
1. J. Chirgwin et al, "Isolation of Biologically ActiveRibonucleic Acid from Sources Enriched inRibonuclease", Biochemistry.18(24): 5294-5299(1979).
2. D. Wallace, "Large-and Small-Scale Phenol
Extractions", Methods in Enzymology.152: 33-41
(1987).
3. Coombs, L. M., Pigott, D., Proctor, A., Eydmann,
M., Denner, J. and Knowles, M. A. "Simultaneous
Isolation of DNA, RNA, and Antigenic Protein
Exhibiting Kinase Activity from Small Tumor Samples
Using Guanidine Isothiocyanate", Anal. Biochem.188:
338-343 (1990).
4. Nicolaides, N. C. & Stoeckert, Jr., C. J. "A
Simple, Efficient Method for the Separate
Isolation of RNA and DNA from the Same Cells",
Biotechniques. 8: 154-156 (1990).
5. J. R. Feramisco, et al., Molecular Cloning: 194-
195, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, N. Y.
6. Raha, S., Merante, F., Proteau, G. and Reed,
J. K. "Simultaneous Isolation of Total Cellular RNA
and DNA from Tissue Culture Cells Using Phenol
and Lithium Chloride", Gene Anal. Techn. 7: 173-177 (1990).
TaKaRa RNAiso Reagent(Total RNA提取试剂)
本制品是一种快速方便的总RNA提取试剂，可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取总RNA。样品在RNAiso Reagent中能够充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层（下层)，RNA分布在上清层中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到总RNA。
RNAiso Reagent具有很强的广谱性，可以适用于各种样品的总RNA提取，提取过程方便快速，整个操作在一小时内便可以完成。经本制品提取的总RNA纯度高，基本不含蛋白质及基因组DNA，提取的RNA可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。
【试剂盒之外所需准备试剂】
氯仿、异丙醇、7 5 % 乙醇（ D E P C 处理水配制) 、RNase-free水（制备方法：使用RNase-free的玻璃瓶，向超纯水中加入DEPC至终浓度0.01%（v/v)，过夜搅拌后，高温高压灭菌。）
保存和运输
1. RNAiso Reagent在室温下可以保存12个月，为保证试剂质量，建议于2-8℃下避光保存。
2. 可以在常温下运输。
RNA提取实验前的准备
RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。
【使用器具】
尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。
1. 用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。
2. 然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。
【试剂配制】
用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60分钟)或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装(也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器)，使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。
实验操作
1. RNAiso Reagent的使用量情况如下。
2. 实验样品的研磨和匀浆。A. 贴壁培养细胞①倒出培养液，用1×PBS清洗一次。
②每10 cm2生长的培养细胞中加入2 ml的RNAiso
Reagent，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于
细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞
使其脱落(对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞)。
③将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
④室温静置5分钟。
B. 悬浮培养细胞
①将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000 g 4℃离心2分钟，弃上清。
②向每5×106个细胞中加入l ml的RNAiso Reagent。
C. 动物组织、植物材料样品
①将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量)。
②对于普通的RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的RNAiso Reagent，将研磨成粉末状的样品完全覆盖， 然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。对于特殊样品，如肝、脾、骨及软骨等，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的RNAiso Reagent的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。
③将匀浆液转移至离心管中，室温静置5分钟。
④ 12,000 g 4℃离心5分钟。
⑤小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀)。
③用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
④室温静置5分钟。
3. 总RNA的提取。
①向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Reagent的1/5体积量)，盖紧离心管盖，用力震荡(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待充分乳化溶液呈乳白状（无分相现象)后，再室温静置5分钟。
② 12,000 g 4℃离心15分钟。
③从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层,即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层)。
④向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟。
⑤ 12,000 g 4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。
4.RNA沉淀的清洗。
小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇l ml(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)。
5. RNA的溶解。
室温干燥沉淀2～5分钟（不可以离心或加热干燥，否则R N A 将会很难溶解， 有关R N A 溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明)，加入适量的RNasefree水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。
RNA提取操作流程简图
FAQs
[Q1] 一般情况下每毫克的组织或1×106个细胞中所能提取的RNA量如下表：
[Q2] 有关RNA的吸光度说明如下：
260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD260/OD280（R）体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8～2.0之间，当R<1.8时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R>2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用TEBuffer。
[Q3] 如何计算RNA的浓度？
RNA浓度=(OD260-OD320)×稀释倍数×0.04 μg/μl。
[Q4] 提取的RNA中含有多糖怎么办？
大多数的植物及动物肌肉组织中都含有大量多糖，其理化学性质与RNA十分接近，因此很难将其从RNA中除去，使用此类组织材料提取RNA时，建议增加RNAiso Reagent的使用量。
[Q5] RNA提取量较低怎么办？
①向组织材料中加入RNAiso Reagent后，请充分研磨匀浆使其充分裂解。
②相分离后请尽量完全回收上清液。
[Q6] 提取的RNA不溶怎么办？
① 75%乙醇清洗沉淀后不要干燥时间过长或加热干燥。
②可以于60℃加热5分钟后再于冰上溶解数小时。
③ RNA沉淀中含有不溶的蛋白质混合物时，应注意在相分离后吸取上清液时，不要让枪头接触蛋白层。
④溶解液更换为0.5%的SDS溶液（DEPC处理水配制)。
[Q7] OD260/OD280值<1.65，为什么？
① RNA应使用TE Buffer稀释后再进行吸光度值的测定，低离子强度或低pH值会使OD280值升高。
②样品裂解时加入的RNAiso Reagent量偏少，造成蛋白变性不充分，可以再次对RNA溶液进行苯酚/氯仿抽提，以除去蛋白。
③含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足5分钟。
③提取的组织材料中含有大量的RNA分解酶，而RNAiso Reagent的添加量不够。
④相分离后，吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染。
⑤ RNA未充分溶解。
[Q8] 提取的RNA降解，为什么？
①使用的组织材料不够新鲜。提取RNA的组织材料应采用新鲜的组织材料，或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存。
②提取RNA时使用的试剂及器材中混有RNA分解酶。
[Q9] 提取的RNA中含有DNA污染，为什么？
①裂解组织或细胞使用的RNAiso Reagent量偏少。
②使用的组织材料中含有大量的有机溶剂（如：乙醇、异丙醇等)、高浓度的Buffer、碱性溶剂等。
③如果提取的RNA中含有DNA时，可以使用DNase I
(RNase Free；TaKaRa Code：D2215）进行DNA消化。
■参考文献
1. J. Chirgwin et al, "Isolation of Biologically ActiveRibonucleic Acid from Sources Enriched inRibonuclease", Biochemistry.18(24): 5294-5299(1979).
2. D. Wallace, "Large-and Small-Scale Phenol
Extractions", Methods in Enzymology.152: 33-41
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3. Coombs, L. M., Pigott, D., Proctor, A., Eydmann,
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Isolation of DNA, RNA, and Antigenic Protein
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4. Nicolaides, N. C. & Stoeckert, Jr., C. J. "A
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Isolation of RNA and DNA from the Same Cells",
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5. J. R. Feramisco, et al., Molecular Cloning: 194-
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Harbor, N. Y.
6. Raha, S., Merante, F., Proteau, G. and Reed,
J. K. "Simultaneous Isolation of Total Cellular RNA
and DNA from Tissue Culture Cells Using Phenol
and Lithium Chloride", Gene Anal. Techn. 7: 173-177 (1990).
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